0400 光譜法

光譜法（spectrometry）是基于物質與電磁福射作用時，測量由物質內部發生量子化的能級之間的躍遷而產生的發射、吸收或散射輻射的波長和強度進行分析的方法。按不同的分類方式，光譜法可分為發射光譜法、吸收光譜法、散射光譜法；或分為原子光譜法和分子光譜法；或分為能級譜，電子、振動、轉動光譜，電子自旋及核自旋譜等。 質譜法（mass spectrometry，MS）是在離子源中將分子解離成氣態離子，測定生成離子的質量和強度（質譜），進行定性和定量分析的一種常用譜學分析方法。嚴格地講，質譜法不屬于光譜法范疇，但基于其譜圖表達的特征性與光譜法類似，故通常將其與光譜法歸為一類。 分光光度法是光譜法的重要組成部分，是通過測定被測物質在特定波長處或一定波長范圍內的吸光度或發光強度，對該物質進行定性和定量分析的方法。常用的技術包括紫外-可見分光光度法、紅外分光光度法、熒光分光光度法和原子吸收分光光度法等。可見光區的分光光度法在早期被稱為比色法。 光散射法是測量由于溶液亞微觀的光學密度不均一產生的散射光，這種方法在測量具有1000到數億分子量的多分散體系的平均分子量方面有重要作用。拉曼光譜法是一種非彈性光散射法，是指被測樣品在強烈的單色光（通常是激光）照射下光發生散射時，分析被測樣品發出的散射光頻率位移的方法。上述這些方法所用的波長范圍包括從紫外光區至紅外光區。為了敘述方便，光譜范圍大致分成紫外區（190～400nm），可見區（400～760nm），近紅外區（760～2500nm），紅外區（2.5～40μm或4000～250cm^-1）。所用儀器為紫外分光光度計、可見分光光度計（或比色計）、近紅外分光光度計、紅外分光光度計、熒光分光光度計或原子吸收分光光度計，以及光散射計和拉曼光譜儀。為保證測量的精密度和準確度，所用儀器應按照國家計量檢定規程或藥典通則中各光譜法的相應規定，定期進行校正檢定。 原理和術語 單色光輻射穿過被測物質溶液時，在一定的濃度范圍內被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關系可以用朗伯-比爾定律表述如下： A=1g（1/T）= Ecl 式中 A為吸光度； T為透光率； E為吸收系數，常用的表示方法（），其物理意義為當溶液濃度為1%（g/ml），液層厚度為1cm時的吸光度數值； c為100ml溶液中所含物質的重量（按干燥品或無水物計算），g； l為液層厚度，cm。 上述公式中吸收系數也可以摩爾吸收系數ε來表示，其物理意義為溶液濃度c為1mol/L和液層厚度為1cm時的吸光度數值。在大吸收波長處摩爾吸收系數表示為εmax。 物質對光的選擇性吸收波長，以及相應的吸收系數是該物質的物理常數。在一定條件下，物質的吸收系數是恒定的，且與入射光的強度、吸收池厚度及樣品濃度無關。當已知某純物質在一定條件下的吸收系數后，可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸光度，即可由上式計算出供試品中該物質的含量。在可見光區，除某些物質對光有吸收外，很多物質本身并沒有吸收，但可在一定條件下加入顯色試劑或經過處理使其顯色后再測定，故又稱之為比色分析。 化學因素或儀器變化可引起朗伯-比爾定律的偏離。由于溶質間或溶質與溶劑的締合及溶質解離等引起溶質濃度改變，將產生明顯的朗伯-比爾定律偏離。非單色入射光、狹縫寬度效應和雜散光等儀器因素都會造成朗伯-比爾定律的偏離。 原子吸收過程基本上遵從朗伯-比爾定律，吸光度與待測元素的原子數目呈正比關系。據此，可建立標準曲線并根據溶液的吸收值計算溶液中元素的濃度。 熒光發射光譜是經光照射的活性物質的發射光分布光譜圖，它以被激發物質發射光的強度為縱坐標，以發射光的波長為橫坐標。熒光激發光譜是激發光分布光譜圖，它以被激發物質發射光的強度為縱坐標，以入射（激發）光波長為橫坐標。如同在吸收光譜中一樣，有機化合物熒光所覆蓋的電磁波光譜重要的區域包括紫外區、可見區和近紅外區等，在250～800nm范圍。當分子吸收光輻射后，能量以熱能的方式消散或以與吸收波長相同或更長的光輻射釋放。光的吸收和發射都是由于電子在分子不同能級間、不同軌道間發生躍遷造成的。在光的吸收和發射間存在時間延遲，對于大多數有機熒光化合物溶液，這一時間間隔也就是分子位于激發態的時間，大約為10^-9～10^-8秒。熒光的壽命很短，可與磷光相區別，后者的壽命一般為10^-3秒到幾分鐘。 拉曼散射活性是一種分子特性（單位cm⁴/g），它決定隨機取向樣品中所觀察的拉曼譜帶強度。拉曼散射活性由產生的分子極化所決定，極化使分子運動而產生拉曼位移譜帶。一般，拉曼譜帶的強度與樣品的濃度呈正比關系。 當各論正文品種中給出紅外光譜或拉曼光譜數據時，字母S、M、W分別代表強峰、中等強度峰和弱峰；sh為肩峰，bd為寬峰，v表示非常的意思。 各光譜法相對適用性 對于多數藥物，紫外-可見光譜法定量測量的準確度和靈敏度要比近紅外和紅外光譜法高。物質的紫外-可見光譜通常專屬性差，但是很適合作定量分析，對于大多數物質也是有用的輔助鑒別方法。近年來，近紅外光譜法的應用日益廣泛，特別是在大量樣品的快速鑒別和水分測定方面。近紅外光譜特別適合測定羥基和氨基，例如乙醇中的水分，氨基存在時的羥基，碳氫化合物中的乙醇，以及叔胺存在時的伯胺和仲胺等。 在不含光學異構體的情況下，任何一個化合物都有一個特定紅外光譜，光學異構體具有相同的紅外光譜。但是，某些化合物在固態時會表現出多晶型，多晶型會導致紅外光譜的差異。通常，結構中微小的差別會使紅外光譜有很明顯的差別。在紅外光譜中呈現大量的吸收峰，有時不需進行預先分離，也可以定量測定成分已知的混合物中的某個特定成分。 拉曼和紅外光譜對于不同的官能團具有不同的相對靈敏度，例如，拉曼光譜對碳硫鍵和碳碳鍵特別靈敏，更容易鑒別某些芳香化合物。水有很強的紅外吸收但其拉曼散射卻特別弱。因此，拉曼光譜幾乎不受水的影響，對含水物的鑒別很有用。拉曼光譜有兩個主要不足：一是低檢測濃度通常為10^-1～10^-2mol/L，二是許多物質中的雜質會發出熒光干擾拉曼散射信號的檢測。 光反射測量法提供的紅外光譜信息與發射光測量法的相似。由于光反射測量法僅探測樣品的表面成分，克服了與光學厚度和物質散射性相關的困難。因此，反射測量用于強吸收物質的檢測更容易。一種常用于紅外反射光檢測的特殊技術被稱為衰減全反射（ATR），也被稱為多重內反射（MIR））。 ATR技術的靈敏度很高，但重現性較差，不是一個可靠的定量技術，除非每個待測成分都有合適的內標。 熒光分光光度法比紫外分光光度法的靈敏度高。在熒光光譜中，空白溶液的信號很低，以致由背景發射產生的干擾要小得多。通常，濃度低于10^-5mol/L的化合物幾乎不能用吸收光譜測定，而熒光光譜的測定濃度可以低至10^-7～10^-8mol/L。 對照品的使用 在鑒別、檢查和定量測定中，使用對照品進行比較時，應保證供試品和對照品在相同的條件下進行測量。這些條件包括波長的設定，狹縫寬度的調整，吸收池的位置和校正以及透光率水平。吸收池在不同波長下透光率可能會有差異，必要時，應對吸收池進行多波長點的校正。 “同法制備”、“相同溶液”等描述，實際上是指對照樣品（通常是對照品）和供試樣品應同法制備，同法檢測。在制備對照品溶液時，制備的溶液濃度（例如10%以內）只是期望濃度的近似值，而吸光度的計算則以的稱量為基礎；如果沒有使用預先干燥的對照品，吸光度則應按無水物計算。 “同時測定”、“同時測量”等描述，是指特定空白溶液的吸光度、對照品溶液的吸光度和供試品溶液的吸光度應立即依序測定。