1、實驗準備

實驗材料及試劑: 紅花、蘆丁、槲皮素，無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、三氯化鋁均為分析純 。

實驗儀器：UV-5200紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）

低速離心機

2、實驗過程

1、標準品配置

1）0.1mg/mL蘆丁標準溶液配制：精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品50mg于500mL容量瓶中，加30％vol乙醇15mL，于30℃水浴鍋中加熱，使之溶解，放冷，以30％vol乙醇定容，搖勻。

2）0.1mg/mL槲皮素標準溶液的配制：精密稱取干燥至恒重的槲皮素對照品50mg于500mL容量瓶中，加30%vol乙醇15mL使之溶解，用30％vol乙醇溶解定容至刻度，搖勻。

2、樣品制備

1）紅花黃酮粗提取液制備：原料清理、干燥、粉碎，過40目篩，備用。取一定量紅花粉狀物，加入65％vol乙醇，料液比1：20，30℃充分浸泡20min，置于50％水浴振蕩器中，振蕩提取2h，過濾，離心取上清液，定容。

2）紅花黃酮純化液制備：取一定量紅花黃酮粗提取液，以lmL/min的吸附流速過AB-8大孔樹脂柱，至吸附飽和。先用蒸餾水洗去雜質，再用65％vol乙醇以lmL/min的洗脫流速洗脫，至洗脫*。

3、直接測定法

移取紅花黃酮粗提取液、紅花黃酮純化液，蘆丁和槲皮素溶液各lmL于10mL具塞試管中，用30％vol乙醇定容，搖勻，在波長200nm-600nm處進行掃描，記錄光譜，如圖A所示。

4、硝酸鋁顯色法

分別取紅花黃酮提取液、紅花黃酮純化液、蘆丁和槲皮素對照品溶液各3mL于3支25mL容量瓶中，各加入30％vol乙醇至10mL，加入5％亞硝酸鈉lmL，搖勻，放置5min，然后又加入10％硝酸鋁lmL，搖勻，放置6min，再加入4％氫氧化鈉10mL，用30％vol乙醇定容，搖勻，放置10min后，進行掃描以不加樣為空白。在波長200nm-600nm處進行掃描，記錄光譜，如圖B所示。

5、氯化鋁顯色法

移取紅花黃酮粗提取液、紅花黃酮純化液、蘆丁和槲皮素溶液各lmL于10mL具塞試管中，加入lmL1％三氯化鋁(乙醇液)，用30％vol乙醇定容，搖勻，放置10min。以不加樣品為空白，在波長200nm-600nm處進行掃描，記錄光譜，如圖C所示
1.蘆丁標準液 2.槲皮素標準液 3.紅花黃酮純化液 4.紅花黃酮粗提

3、實驗結果分析

試驗分別對紅花黃酮粗提取液、紅花黃酮純化液、蘆丁標準液及槲皮素標準液采用不同顯色反應后，在波長200nm~600nm處進行波長掃描，結果見圖A、B、C。

從圖A可以看出，在波長200nm~400nm處，蘆丁與槲皮素均存在2個主要的紫外吸收帶，即蘆丁在波長267nm和363nm處有明顯吸收峰、槲皮素在波長256nm和374nm處有明顯吸收峰。紅花黃酮粗提液與紅花黃酮純化液在波長332nm處有明顯吸收峰。可見，蘆丁和槲皮素的吸收峰位置與紅花黃酮的吸收峰位置吻合性較差，故不能采取直接法測定紅花黃酮含量。

圖B是硝酸鋁顯色法的測定結果，也是目前常用的測定黃酮的方法。由圖B發(fā)現，蘆丁加硝酸鋁顯色后在波長510nm處有明顯紫外吸收峰，槲皮素和紅花中的主要黃酮類化合物在該法常用的波長510nm處均無明顯吸收峰，說明紅花中的黃酮物質不具有該顯色法所要求的化學基團。因此，槲皮素和蘆丁此時均不能選為標準品，同時也可說明，硝酸鋁法并不適合紅花中黃酮含量的測定。

從圖C可以看出，紅花黃酮粗提液、紅花黃酮純化液、蘆丁與槲皮素在波長400nm~450nm處都有明顯的吸收峰，吻合性較好，且吸收鋒位置基本一致。在波長400nm~450nm處，蘆丁的紫外吸收峰在波長422nm處，槲皮素在波長436nm處，紅花黃酮純化液與紅花黃酮粗提液均在波長406nm處。由此可見，蘆丁和紅花黃酮的吸收峰位置更相近，并且蘆丁易得且價格相對更低。因此，試驗選擇以蘆丁為標準品，測定波長為406nm作為測定方法。用蘆丁作為標準品繪制標準曲線，分別精密吸取蘆丁標準液0mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL、2.0mL與2.2mL，再各加入1.0mL1％三氯化鋁，用30％vol乙醇定容至10mL，放置l0min后，在波長406nm處測定吸光度值，并建立回歸方程：y=33.673x+0.0046, R2=0.99974、結論

采用上海元析儀器有限公司的UV-5200紫外-可見分光光度計對紅花中黃酮類化合物在200nm~600nm波長范圍內進行光譜掃描實驗，實驗結果表明可采用氯化鋁顯色法，選擇蘆丁作為標準品，406nm作為特征波長進行實驗，*測定紅花黃酮類化合物的日常實驗要求。